7.4. Люминесцентный метод

Люминесцентный метод основан на явлении люминесценции, т. е. свойстве атомов и молекул выделять поглощенную ими энергию в виде потока квантов. Это явление имеет следующее теоретическое объяснение. Энергия любой молекулы или атома, находящихся в нор-мальном, равновесном состоянии, характеризуется определенным энергетическим уровнем. При облучении светом молекула поглощает часть энергии и в результате этого переходит на новый энергети-ческий уровень. После снятия облучения молекула самопроизвольно возвращается на прежний уровень, испуская при этом поглощенную порцию энергии. Это и вызывает свечение – люминесценцию. Из-за сложности своего строения молекула поглощает и испускает кванты энергии не одной определенной длины волны, а в некотором их интервале. Совокупность значений длины волны, вызывающих свечение вещества, называется спектром возбуждения. Молекулы обладают и спектром излучения, под которым понимается совокупность значений длины волны энергии, излучаемой люминесцирующим веществом. Иными словами, спектры возбуждения и излучения определяют границы активного поглощения и излучения, приводящего к возникновению свечения.

Каждое вещество имеет свои характерные спектры излучения, которые отличаются шириной и положением максимума интенсивности, что определяет цвет и интенсивность свечения. Меняя длину волны падающего света, можно найти ту область облучения, при которой начнут люминесцировать молекулы интересующего компонента исследуемой системы. Это позволяет применять люминесценцию для качественного анализа, который чаще всего основывается на самом факте возникновения или исчезновения свечения.

Для количественного анализа используют зависимость интенсивности свечения от концентрации в растворе анализируемого вещества. Однако эта зависимость имеет линейный характер только при малых значениях молярной концентрации – до 10^–7–10^–4 моль/л, что и определяет верхнюю границу диапазона измерений.

Сравнительно немногие вещества обладают люминесцентными свойствами в чистом виде. Однако номенклатура анализируемых этим методом веществ значительна за счет применения специальных реагентов, переводящих определяемый компонент в соединение, об-ладающее этим свойством.

Приборы, основанные на люминесцентном методе измерения, называются флуориметрами. Их устройство аналогично рассмотрен-ным выше спектрофотометрам.

Одним из главных преимуществ люминесцентного метода ана-лиза является высокая чувствительность – около 0,01 млн^–1. Погрешность измерения составляет от одного до нескольких процентов. Для флуориметров характерны те же источники погрешности, что и для спектрофотометров. Однако имеются и специфические погрешности, связанные с интенсивностью свечения, влиянием температуры и сопутствующих веществ, в том числе растворителя; на интенсивность свечения влияет и кислотность среды.

Применение люминесцентных методов весьма разнообразно. Интенсивным свечением обладают, например, канцерогенные вещества, многие гнилостные бактерии, что используется в биологии, медицине для анализа качества лекарств и пищевых продуктов. Например, жизнеспособные семена имеют желтую, а нежизнеспособные – коричневую люминесценцию. Очень полезным оказалось применение этих методов в археологии, криминалистике, судебной экспертизе.

В пищевой промышленности широко используется явление флуоресценции – разновидности люминесценции, в которой источником возбуждающего электромагнитного излучения служит ультрафиолетовый или видимый свет с длиной волны от 250 до 500 нм. Люминесценция предназначена для идентификации и количественного анализа витаминов, белков, жиров, углеводов и др.; для диагностики порчи овощей, плодов; обнаружения в продуктах питания консервантов, канцерогенных веществ; для определения сорта муки и наличия в ней примесей; для контроля всхожести семян и пр.

Несомненными достоинствами спектрального люминесцент-ного метода являются следующие: во-первых, анализ продуктов проводится без их разрушения, в отличие от химического, калориметрического, хроматографического и других методов, на основе собственной люминесценции ряда компонентов (например, ароматических аминокислот, витаминов, полиненасыщенных жирных кислот и т. п.); во-вторых, высокая чувствительность и точность. Спектрально-лю-минесцентные свойства органических молекул определяются в основном особенностями электронной структуры, так как именно от них зависит вероятность протекания тех или иных процессов в электронно-возбужденных молекулах.

Большинство органических молекул поглощают свет и испускают его (люминесцируют) в ближней ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Поглощение и испускание света в этом случае обусловлено перепадами между электронно-колебательными состояниями молекул. Спектры люминесценции содержат, как правило, большое количество полос излучения, что обусловлено наличием целого ряда люминесцирующих компонентов. Для идентификации конкретного люминесцирующего компонента необходимо выделить отдельную полосу излучения, что осуществляется при помощи светофильтров и монохроматоров.

В качестве источников возбуждения используются лампы накаливания, газоразрядные лампы и лазеры.

Примеры использования люминесцентного метода:

– определение остаточных загрязнений молочного происхождения. Метод основан на том, что под воздействием УФ-об-лучения остатки молочных продуктов люминесцируют. Зависимость интенсивности люминесцентного излучения от количества загрязнения на облучаемой поверхности носит линейный характер;

– оценка санитарно-гигиенического состояния самосогревшегося и заплесневевшего зерна. Предложенные экспресс-методы оценки поражения зерна грибками и выявления фузарнозного зерна основаны на биолюминесцентном спектральном анализе. Для выявления загрязненного афлатоксинами зерна применяется косвенный метод желто-зеленой флуоресценции (ЖЗФ), сущность которого заключается в просматривании навески зерна под источником УФ-света в затемненном помещении. Нормальные зерна при этом флуоресцируют тускло-фиолетовым светом, а пораженные грибками и афлатоксинами – желто-зеленым;

– диагностика загрязнения окружающей среды с помощью фотосинтезирующих бактерий, водорослей, низших и высших растений, обладающих фотосинтетической люминесценцией (послесвечение, замедленная люминесценция). Так, обнаруженное замедление люминесценции различных биопрепаратов и семян растений с низкой влажностью (менее 15 %) позволило разработать очень быстрые и чувствительные методы измерения влажности препаратов и оценки жизнеспособности семян без их проращивания. Другое явление – резонансная ядерная флуоресценция, т. е. излучение, поглощение и рассеяние гамма-квантов без отдачи (без расходования части энергии ядерного перехода на отдачу излучающего и поглощающего гамма-квант ядра);

– радиотермолюминесцентная спектроскопия (РТЛ) основана на следующем явлении: если органический объект облучить при низком значении температуры лучами или электронами, то при последующем нагревании он будет светиться. При использовании метода РТЛ снижается зависимость интенсивности свечения продукта от температуры. При разогреве облученного органического вещества интенсивность термолюминесценции существенно меняется в том интервале температур, где проявляется молекулярная подвижность. Кривая высвечивания РТЛ очень сильно зависит от дозы облучения и скорости разогрева. Радиотермолюминесцентная спектроскопия является единственным методом, позволяющим изучать молекулярную подвижность и структуру сверхтонких слоев органических веществ;

– в клетках высших растений и животных биолюминесценция не обнаружена, а наблюдается только сверхслабое свечение – биохемилюминесценция. И биолюминесценция и биохемилюминесценция – результат окислительных реакций с участием кислорода, причем возбужденные молекулы возникают в результате распада диоксидантов. Поскольку существует зависимость между свечением живых организмов и их функциональным состоянием, следовательно, явление хемилюминесценции можно использовать на практике. В частности, по интенсивности свечения можно судить о ходе технологического процесса или о концентрации химического соединения в смеси. В растениях различают очень слабую спонтанную хемилюминесценцию (ХЛ), вызванную протеканием в них метаболических процессов, и ХЛ, индуцированную некоторыми добавками (Н₂О₂, КО₄ и пр.).

Индуцированную ХЛ следует отличать от фотолюминесценции – послесвечения биообъекта, предварительно облученного коротким импульсом света.

Основным направлением использования ХЛ-анализа является исследование физиологического состояния овощей, фруктов, семян. Например, ХЛ-метод используется для автоматической диагностики болезней картофеля. С этой целью измеряют уровень сверхслабого свечения:

– принципиально возможны разработки на основе хемилюми-несценции методов контроля содержания в мясопродуктах белковых добавок растительного и животного происхождения, пищевых добавок, содержащих кислоты, карбоксильные, красящие и ароматические компоненты. Успешно используют метод хемилюминесценции для контроля за содержанием в мясопродуктах нитритов, одновременного анализа Сu и Со в молоке. Это связано с тем, что ионы меди II, кобальта II и хрома III непосредственно усиливают свечение, а железо (Fe) катализирует реакцию только в присутствии активаторов – органических аминов. Данный метод отличают высокая чувствительность, селективность и простота исполнения;

– ХЛ-метод применим для анализа микроколичества аскорбиновой кислоты в некоторых продуктах. В основу разработанной методики положен ингибиторный эффект аскорбиновой кислоты. На этом принципе основан метод оценки жизнеспособности дрожжей при регидрации.

Приборная реализация рассмотренных методов принципиально не представляет больших трудностей.

Биолюминесцентный АТФ-метод микробиологического конт-роля. Способностью к люминесценции обладают некоторые бактерии, простейшие, грибы, черви, ракообразные и в особенности насекомые (светлячки). Для многих из них характерны ферментативные окислительно-восстановительные реакции, при которых изменение свободной энергии используется для возбуждения молекул состояния с повышенной энергией. Последующее возвращение молекул в основное состояние сопровождается излучением в видимой области спектра, которое называется биолюминесценцией.

Рассмотрим возможности метода для микробиологического контроля в области экологии, медицины, гигиены, контроля ряда продуктов.

Медицина. Показана эффективность применения метода АТФ/БЛ на восприимчивость антибиотика и на бактериальное обсеменение в ранах и тканях.

Экология. Подтверждена эффективность метода АТФ/БЛ для определения бактериальной зараженности природной и питьевой воды, для контроля ила и в процессе очистки сточных вод.

Технология и биотехнология. Экспресс-анализ на биорезистент-ность к действию грибков и контроль токсичности полимеров, смазок, топлива, для оценки качества золы, используемой для производства фармацефтических препаратов.

Контроль качества продовольствия. Метод АТФ/БЛ с успехом применяется для оценки бактериального заражения молочных изделий, мясопродуктов, соков и пищевого оборудования.

Микробиологический контроль парфюмерно-косметической продукции. Успешно применяется для оценки зараженности парфю-мерного сырья.

Методически метод АТФ/БЛ микробиологического контроля требует реагенты и люменометры. Основными реагентами метода являются следующие компоненты:

1) бульоны с низким содержанием АТФ;

2) биолюминесцентные наборы;

3) стандарты АТФ.

В качестве примера приборного оформления люминесцентного метода измерения рассмотрим люменометр фирмы "Bio-Orbit-Oy" модели 1251. Этот прибор предназначен для измерения количества микроорганизмов в продуктах личной гигиены (шампуни, косметические кремы, лосьоны для душа, зубные пасты, жидкости для мытья посуды), а также в необходимых для их производства сырьевых материалах. Область применения люменометра – аналитические лаборатории научно-исследовательских институтов и промышленных предприятий. Люменометр модели 1251 работает в УФ-области и основан на явлении биолюминесценции. Метод АТФ-биолюминесцен-ции представляет собой методику, которая применяется для контроля микробиологического качества детергентов и продукции личного пользования, а также необходимых для производства сырьевых материалов.

Образцы подвергаются инкубации в питательном бульоне в течение по меньшей мере 18 ч. Микроорганизмы, растущие в бульоне, провоцируют аденозинтрифосфат (АТФ); его наличие может быть выявлено в ходе ферментативной реакции, которая дает свечение. Оценка количества микроорганизмов осуществляется относительно установленного порогового значения, равного 1,40, что соответствует количеству микроорганизмов, равному 300.

В качестве стандарта используется люциферин – люциферазная система американского светлячка, цвет хемилюминесценции которой желто-зеленый с длиной волны 565 нм.

Управление работой люменометра осуществляется с помощью встроенного микропроцессора.

Основные технические характеристики:

спектральный диапазон – 190...680 нм;

рабочая длина волны – 565 нм;

пределы допускаемой относительной погрешности на λ = 565 нм составляет 10 %;

порог срабатывания для количества колоний микроорганизмов, равного 300 (1,40 условные единицы).