Классификация методов разделения

Рассмотрим наиболее перспективные из приведенных в таблице методов.

К хроматографическому анализу относятся методы, основанные на разделении смеси веществ сорбционными способами в динамических условиях. Эти методы эффективно применяются для разделения и анализа органических и неорганических соединений. Применение хроматографии для аналитических задач основано на использовании физических и химических процессов, имеющих место во время хроматографических разделений. Данный метод настолько надежен, что вещество может считаться однородным, если не удалось разделить его этим методом.

В основу хроматографического метода положены разделение анализируемой смеси на составляющие ее компоненты, последующее выделение их из сорбента и измерение их концентраций. Выходная информация приборов, основанных на хроматографическом методе, – хроматографов записывается в виде хроматограмм, состоящих из ряда пиков, каждый из которых соответствует определяемому компоненту (рис. 3.1). Площадь цикла пропорциональна содержанию компонента в смеси, а его положение на временной шкале отражает индивидуальные свойства компонента в анализируемой системе.

а

Для понимания физической сущности хроматографического метода необходимо ввести несколько понятий.

Сорбция – процесс поглощения газов и жидкостей телами. Ее разновидности: адсорбция – сорбция веществ на поверхности твердых тел и абсорбция – сорбция веществ жидкими телами.

Десорбция – отдача сорбированного вещества телом, т. е. процесс, обратный сорбции.

Сорбент – тело, обладающее сорбционными свойствами, адсорбент – адсорбционными свойствами и абсорбент – абсорбционными.

Сорбат – сорбируемое вещество.

На поверхности сорбентов действует силовое поле. Молекулы веществ, попадая в него, притягиваются к поверхности сорбента и образуют на ней мономолекулярный слой. Сорбируемость различных веществ на одном и том же сорбенте неодинакова: одни сорбируются легче, другие труднее. Это свойство, называемое сродством, и используется для сорбционного разделения протекающей через сорбент смесей. При повышении кинетической энергии молекулы сорбата до уровня, превышающего энергию ее удержания на поверхности, наступает процесс десорбции – отрыва молекулы от сорбирующей поверхности.

Путем изменения температуры можно подобрать такие условия, при которых наступает сорбционное равновесие, когда количество молекул, попадающих на сорбционную поверхность, равно количеству молекул, отрывающихся от нее. При этом сорбционная активность различных веществ по отношению к данному сорбенту останется разной. За счет этого при протекании через слой сорбента газовой или жидкостной смеси молекулы компонентов будут испытывать притормаживающее воздействие сорбента, причем тем большее, чем выше их сродство с данным сорбентом. При достаточной длине сорбционного слоя в результате этого произойдет расслоение смеси на отдельные компоненты, что фиксируется на выходе из слоя специальными устройствами, называемыми детекторами.

Если разделяемые вещества имеют различную окраску, то на белом сорбенте будут образовываться слои разной окраски. Именно это наблюдал М.С. Цвет в своих опытах с хлорофиллом, приведших к открытию хроматографии (в переводе означает «запись цвета»). Он пропускал через слой CaCOз раствор зерен хлорофилла в петролейном эфире, окрашивающего, как известно, листья растений в зеленый цвет. Результатом было появление адсорбционных слоев разного цвета, которые М.С. Цвет и назвал хроматограммой по аналогии с тем, как из белого луча получается спектр.

Визуальный способ хроматографирования применяется в определенных условиях и сегодня, однако современные измерительные средства позволяют анализировать содержание каждого разделенного компонента, не имеющего характерной окраски, или вообще бесцветных.

Для того чтобы сделать хроматограмму по зонам более четкой, адсорбент после окончания всего процесса разделения промывают растворителем, имеющим активность по отношению к сорбенту большую, чем все компоненты. Каждая зона под воздействием сдвигается, и между ними образуется некоторый разрыв. Этот процесс называется проявлением хроматограммы. При достаточно большом количестве раствора слои сорбированных веществ вымываются совсем, на выходе из сорбционного слоя получается струя растворителя, содержащего как бы послойно все вещества анализируемой смеси. Их зонные концентрации в растворителе могут служить мерой концентрации этих веществ в смеси. В этом и состоит сущность инструментального хроматографического метода. В задачу исследователя входит подбор сорбента, отвечающего составу анализируемой системы, условий проявления и расшифровка хроматограммы.

Хроматографические методы анализа чрезвычайно разнообразны и различаются по видам применяемых сорбентов, типу используемой подвижной фазы и т. д.

По способу выполнения хроматографические методы подразделяются на проявительный, фронтальный и вытеснительный. Проявительный метод заключается в том, что сорбаты переносятся через слой сорбента потоком вещества (элюента), сорбирующегося хуже любого из сорбентов. При этом разделенные вещества А, В, С выделяются из сорбционного слоя в потоке элюента отдельными зонами, в промежутке между которыми находится чистый элюент (см. рис. 3.1, а). Достоинствами этого метода являются непрерывность регенерации (восстановления) сорбента и возможность практически полного разделения компонентов смеси; недостатком –  значительный расход элюента. Вытеснительный метод заключается в переносе разделяемой смеси потоком вещества (вытеснителя), сорбирующегося лучше любого из компонентов смеси. При этом образуются отдельные примыкающие друг к другу зоны компонентов, которые располагаются в порядке увеличения их сорбируемости (см. рис. 3.1, б). Недостатком метода является необходимость регенерации сорбента, а также то, что зоны отдельных компонентов вплотную примыкают друг к другу. Фронтальный метод основан на непрерывном пропускании исследуемой смеси через слой сорбента. При этом на сорбенте образуются зоны, содержащие последовательно уменьшающееся число компонентов; из колонки вначале выходят порции наименее сорбируемого вещества, а в конце – порция, состав которой соответствует составу исходной смеси (см. рис. 3.1, в). Достоинствами метода являются простота проведения опыта и отсутствие необходимости в элюенте; недостатками – необходимость регенерации сорбента после каждого анализа, возможность получения в чистом виде только первого компонента.

По природе используемого сорбента хроматография подразделяется на следующие основные виды:

– газоадсорбционную, при которой в качестве сорбентов используют твердые пористые вещества;

– газожидкостную, при которой в качестве сорбентов используют нелетучие жидкие растворители, наносимые на пористые твердые носители с большой поверхностью;

– капиллярную, представляющую собой разновидность газо-жидкостной, когда нелетучий жидкий растворитель наносят на внутреннюю поверхность капиллярной разделительной колонки, длина которой достигает нескольких десятков и даже сотен метров.

В зависимости от способа оформления процесса разделения различают колоночную и плоскостную хроматографию. Колоночная хроматография отличается тем, что процесс разделения происходит в насадочной (или капиллярной) колонке, называемой хроматографической. Ее заполняют сорбентом (насадкой) или внутреннюю ее стенку покрывают жидким либо пылевидным сорбентом. Плоскостная хроматография осуществляется на плоскости, которой может быть бумага, пропитанная сорбентом (хроматография на бумаге), или стек-лянная пластинка со слоем сорбента (тонкослойная хроматография).

Большинство хроматографов состоят из разделительной (хроматографической) колонки с неподвижной фазой, источника подвижной газовой фазы, служащей для транспортирования анализируемой смеси через хроматограф, и устройства для фиксирования разделенных элементов – детектора. Кроме того, они могут включать в себя ряд вспомогательных приспособлений для введения анализируемой пробы, приборы для контроля и регулирования расхода газа, а также устройства обеспечения постоянства температуры колонки и детектора.

Структурная схема хроматографа показана на рис. 3.2. Газ через колонку 4 пропускают от источника 1 сжатого газа (как правило, баллона) с постоянной скоростью (за счет регулятора расхода), определяемой по измерителю расхода 5. Дозатор-испаритель 2 служит для ввода анализируемой пробы в колонку. Обычно проба очень мала, поэтому ее вводят микрошприцем через самозатягивающуюся термостойкую резину. Анализируемая проба, введенная в дозатор, подхватывается потоком газа-носителя и подается в хроматографическую колонку. Если анализируемая проба – жидкость, то она предварительно в дозаторе-испарителе переводится в парообразное состояние. Чувствительный элемент – детектор 3 регистрирует присутствие разделенных компонентов в газе-носителе. Вторичный прибор 6 записывает хроматограмму в виде выходных кривых на временной оси.

Рис. 3.2. Структурная схема хроматографа: 1 – источник газа; 2 – дозатор-испаритель; 3 – детектор;

4 – колонка; 5 – измеритель расхода; 6 – вторичный прибор

Современные автоматические хроматографы снабжаются специальными устройствами для обработки хроматограмм. Она заключается в распознавании хроматографических пиков, определении их параметров и проведении вычислительных операций.

Хроматографическая колонка представляет собой металлическую или стеклянную трубку диаметром 2–5 мм, свернутую в спираль либо состоящую из отдельных U-образных секций. Длина колонки выбирается в зависимости от состава анализируемой смеси эмпирически, поскольку в настоящее время нет достаточно точных методов ее расчета.

Сорбенты, применяемые в хроматографических колонках, должны иметь максимально возможную поглотительную способность (отношение массы поглощенного вещества к массе сорбента), быть устойчивыми по отношению к той среде, в которой они применяются, и обладать механической прочностью в условиях эксплуатации. В настоящее время наибольшее применение получили активированный уголь, силикагель, окись алюминия, цеолиты, некоторые минералы, целлюлоза и ионно-обменные смолы. Каждому из них могут быть приданы специфические свойства в зависимости от условий его будущего применения.

В качестве подвижной фазы в хроматографии чаще всего используют чистые инертные газы, которые должны обеспечивать перемещение анализируемой смеси вдоль слоя сорбента, отвечать требованиям работы соответствующих детекторов и не вступать в какие-либо реакции с анализируемым веществом, сорбентом и материалом хроматографической колонки. В качестве таковых используют азот, водород, гелий, аргон, двуокись углерода, воздух, кислород, неон, криптон и др.

Детекторы являются важнейшей частью любого хроматографа. От совершенства детектора во многом зависят чувствительность и точность хроматографического устройства в целом, параметры хро-матографической колонки (диаметр и длина), размер пробы, а также условия проведения анализа (температура, давление в газовом тракте, расход и скорость анализируемой пробы и др.). Детекторы подразделяются на дифференциальные и интегральные.

Дифференциальные детекторы, применяемые наиболее широко, обеспечивают измерение концентрации анализируемых компонентов в данный момент и дают на выходе измерительный сигнал, зависящий от какого-либо физико-химического свойства этих компонентов. Так как выход анализируемого компонента длится некоторое время, выходная информация записывается в виде пиков на временной оси. Действие большинства дифференциальных детекторов основано на использовании различия в теплопроводности анализируемых компонентов и подвижной фазы (так называемые термокондуктометрические детекторы, или катарометры), а также на измерении электропроводности ионизированных компонентов анализируемой смеси (ионизационные детекторы). Для специальных видов хроматографического анализа применяют пламенные, термохимические, пневматические и детекторы некоторых других типов.

Интегральные детекторы дают на выходе сигнал, показывающий зависимость во времени суммарного содержания компонентов анализируемой смеси, а на диаграмме (хроматограмме) представляют собой ряд ступеней, высота каждой из которых пропорциональна количеству компонентов, присутствующих в смеси (см. рис. 3.2).

Большое значение имеет калибровка детекторов, от которой во многом зависит точность анализа. Она состоит в том, чтобы с необходимой точностью определить место и площадь пиков хроматограммы, отвечающих каждому анализируемому компоненту.

Количественный анализ хроматографическим методом основан на том, что площади пиков индивидуальных веществ на хроматограмме, а также их высоты пропорциональны количеству или концентрации их в смеси. Площади пиков измеряют различными способами в зависимости от размеров, симметричности и полноты разделения. Наиболее распространены следующие способы измерения: по площади треугольника, основание которого равно расстоянию между точками пересечения касательных в точках перегиба с нулевой линией; умножение высоты пика на его ширину по половине высот; взвешивание вырезанных пиков; при помощи планиметров и автоматических интеграторов.

Для расшифровки хроматограмм проводят калибровку. Наиболее распространены следующие способы калибровки. При абсолютной калибровке в дозатор-испаритель поочередно вводят определенное количество каждого чистого компонента, находят соответствующие им значения высоты или площади пиков и таким образом, строят калибровочный график, по которому и находят пересчетные коэффициенты. Данный способ чаще всего применяют в тех случаях, когда необходимо определить не все компоненты анализируемой смеси, а только один или два.

Способ внутреннего стандарта основан на добавлении известного количества определяемого вещества, называемого внутренним стандартом. Поправочный коэффициент для него принимают равным единице. При использовании этого способа нет необходимости измерять точно размер анализируемой пробы. Для калибровки строят график зависимости отношения площади или высоты пика определяемого компонента и внутреннего стандарта от отношения значений массы обоих веществ. Этот способ калибровки удобен, поэтому наиболее часто применяется. Однако его применяют только тогда, когда определяют не все компоненты пробы.

Метод нормализации основан на том, что сумма значений площади всех пиков на хроматограмме с учетом соответствующих поправочных коэффициентов принимают за 100 %. На основании этого содержание определяемого вещества рассчитывают при помощи соответствующих простых соотношений. Достоинством способа является возможность измерения концентрации всех компонентов. Существенные недостатки – необходимость полного разделения и идентификации всех компонентов смеси, а также обязательное нахождение поправочных коэффициентов для каждого пика, хотя при этом определять некоторые вещества нет необходимости.

При использовании стандартной аппаратуры хроматографи-ческие измерения можно проводить с относительной погрешностью 5–10 %. На хроматографах высшего класса, имеющих более стабильные параметры работы, эта погрешность составляет (2 ± 0,2) %.

Таким образом, для получения точных количественных данных необходимо обращать внимание на качество применяемой аппаратуры, добиваться наибольшей полноты разделения за счет тщательного выбора сорбентов и условий работы, правильно выбирать метод калибровки, тщательно готовить калибровочную смесь и использовать наиболее рациональные приемы измерения параметров пиков.

Промышленность выпускает различные анализаторы для анализа определенных веществ, основанные на хроматографическом методе. Такие специфические приборы, обладая всеми преимуществами данного метода, за счет индивидуальной узкой настройки имеют небольшие габаритные размеры, простое устройство и шкалу, отградуированную в единицах концентрации, надежны и удобны в эксплуатации.

В жидкостной хроматографии последним нововведением являются колонки с микродиаметром (например, набивные кварцевые микроколонки), использование которых ведет к сокращению расхода растворителя на 95 % по сравнению с традиционными колонками. Чувствительность увеличивается в 10–20 раз. Достоинством также является возможность совмещения газовой хроматографии и масс- спектроскопии.

В газохроматографическом анализе особое развитие получили стеклянные капиллярные колонки, позволяющие на двух-трех неподвижных фазах разделять практически любые вещества. Эффективность таких колонок достигает сотен тысяч теоретических тарелок.

Для ионной хроматографии характерным является отказ от супрессной колонки за счет применения высокочувствительных кондуктометрических детекторов. Они способны регистрировать изменение электропроводности в 10^–5–10^–6 от электропроводности фонового электролита.

Высокоэффективная тонкослойная жидкостная хроматография для многих случаев является наиболее эффективным хроматографическим методом. Размер пластин для этого метода меньше, чем размер пластин для обычной тонкослойной хроматографии. Адсорбционное, однородное покрытие этих пластин имеет более равномерную толщину, поскольку содержит частицы меньшего размера. Это ведет к выравниванию скорости потока элюента. Разделение происходит быстро, так как проба, наносимая на пластину, очень мала, обычно менее 0,5 мкл, поэтому растворителю достаточно пройти всего 3–4 см.

Другое достоинство метода тонкослойной жидкостной хроматографии – высокая чувствительность.

Относительно новым в хроматографии является метод зонной газовой хроматографии. В нем узкий тепловой импульс прямоугольной формы медленно сканирует относительно короткую колонку по направлению движения газа-носителя, что обеспечивает необычные разделения и одновременно создает благоприятные условия для «холодного» хранения в колонке неэлюированных компонентов (для их элюирования в последующих сканированиях). Тепловой импульс создается узкой печью, укрепленной на колонке и движущейся вдоль нее. После каждого сканирования определяют состав элютрованной фракции с использованием аналитической колонки, установленной после зонной колонки. Метод хорошо зарекомендовал себя в много-мерной газовой хроматографии для предварительного разделения пробы на линии (зонная колонка заменяет предварительную колонку).

Зонная газовая хроматография может использоваться также для разделения веществ с близкими значениями молекулярной массы. Для реализации этого метода используют колонки, в которых разделение соединений производится путем регулирования температуры колонки при помощи нагревательного устройства. Эти колонки предназначены для анализа пищевых продуктов и напитков на содержание органических кислот. Достоинствами данных колонок являются большая избирательность, обеспечиваемая контролируемой ионизацией, стабильность и долговечность. Они могут использоваться для разделения веществ с близкими значениями молекулярной массы, например изолимонной и лимонной кислот.

В методе сверхкритической флюидной хроматографии носителем является флюид, поддерживаемый в состоянии выше его точки критической температуры. Плотность сверхкритического флюида близка к плотности жидкой фазы. Вязкость сверхкритической фазы такая же, как газовой фазы, что обеспечивает легкий перенос массы. Теплопроводность относительно большая. Коэффициент диффузии (самодиффузии) сверхкритической фазы имеет промежуточное значение между коэффициентами диффузии газа и жидкости. В литературе описываются преимущества и области применения сверхкритической флюидной хроматографии. В большинстве случаев сверхкритическая флюидная хроматография применяется для решения аналитических и разделительных задач. Преимущества сверхкритической флюидной хроматографии – во времени экстрагирования и, следовательно, повышении производительности; большая эффективность экстрагирования. Путем использования различных сверхкритических флюидов (СО₂ и др.), модификаторов давления или температуры возможно повышение селективности.

Основные направления развития хроматографии:

– совмещение жидкостной хроматографии с газовой. Используется для разделения специфических веществ, которые трудно разделить одним методом. Жидкостная хроматография используется для предварительной обработки пробы (разделения ее на фракции, обогащения, разбавления, очистки) перед ее последующим газохроматографическим анализом. Это совмещение позволяет устранить многие проблемы, связанные с потерями вещества, загрязнением пробы, и в то же время облегчает процедуру, улучшает чувствительность и количественную оценку. Кроме того, жидкостная и газовая хроматографии дают два ряда независимых данных удерживания веществ, что значительно упрощает их идентификацию;

– сочетание нескольких набивных колонок, например, в сверхкритической флюидной хроматографии для анализа пестицидов;

– сочетание газовой хроматографии с масс-спектрометрией, это дает очень мощный аналитический метод анализа сложных смесей. Трудность заключается в том, что не все компоненты смеси могут быть хроматографически разделены, даже с помощью высокоэффективной капиллярной газовой хроматографии. В результате получаемые масс-спектры представляют смеси компонентов, что вызывает ошибки при идентификации. Для их устранения используются различные приемы – от простейшей программы вычитания фона до сложной спектральной реконструкции спектра или факторного анализа;

– для системы «жидкостная хроматография + масс-спектро-метрия» появился новый метод ионизации – термораспыление. Его использование позволяет получать спектры значений массы широкого круга термически неустойчивых соединений;

– известны гибридные методы, включающие электрофорез, гельпроникающую хроматографию, микрохимический метод отпечатков и аминокислотный анализ для анализа высокомолекулярных веществ в пищевых жидкостях. «Гибридизированы» методы аналитической ультрафильтрации и гельпроникающей хроматографии;

– разработана методика газохроматографического измерения остаточного количества оловоорганических пестицидов в зерне, соломе яровой пшеницы и ячменя, клубнях картофеля. Идентификация оловоорганических соединений производится по эталонным веществам и методом тонкослойной хроматографии;

– сочетание в сверхкритической флюидной хроматографии нескольких набивных колонок (используется для разделения сложных смесей, например при анализе пестицидов);

– прямое сочетание сверхкритической флюидной хроматографии колонками с капиллярной газовой хроматографией (используют для характеристики классов углеводородов в сложных углеводородных потоках веществ путем селективного переноса фракций в другую колонку);

– изучены возможности совмещения сверхкритической флюидной хроматографии и газовой хроматографии для анализа потоков различных сложных систем.

Применение газохроматографических методов при измерении влажности дает результаты, которые по точности не уступают результатам, полученным кулонометрическим методом. Например, хроматографическая методика применяется для экспресс-измерения влажности салатов, соусов, первых и вторых блюд.

Хроматографические методы занимают особое место среди современных методов контроля качества жиров в молочной, масло- и сыродельной отраслях пищевой промышленности, в частности для идентификации замены молочного жира дешевыми добавками, комбинированными маслами и маргаринами. В этих и ряде других ситуациях традиционные методы анализа физико-химических показателей часто недостаточны решения технологических вопросов, для оценки качества и проверки аутентичности жиров. Один из наиболее информативных методов идентификации жиров – хромато-масс-спектрометрия. В этом методе сочетается газовая хроматография летучих производных жирных кислот с получением масс-спектров разделенных компонентов. Метод применяется в научных исследованиях, криминалистике, судебно-медицинской экспертизе, при решении арбитражных вопросов. По характеру масс-спектров можно идентифицировать строение всех жирных кислот. Аналогичное заключение можно сделать по высокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещенной с ядерно-магнитным резонансным спектрометром.

В ближайшей перспективе относительно недорогим и чрезвычайно селективным методом измерения жирно-кислотного, углеводного и аминокислотного состава может стать новейший метод, относящийся к хроматографическим по ряду признаков, – капиллярный электрофорез.

В мировой практике наблюдается массовый переход лабораторий на капиллярную газовую хроматографию (КГХ) взамен насадочной. Этим способом можно измерять жирно-кислотный состав образца жира, а при наличии в комплекте к газовому хроматографу парофазной приставки и пиролизера (недорогое дополнителное оснащение) можно получить еще хроматограммы летучих компонентов (запаха) и продуктов пиролиза жиров. Парофазный анализ и пиролитическая хроматография на газовых хроматографах прошли широкую апробацию в криминалистической практике, они существенно повы-шают надежность идентификации, выполненной по жирно-кислот-ному составу, так как летучие компоненты животных и растительных жиров достаточно специфичны. Пирограммы, как и отпечатки паль-цев, неповторимы, но для разных групп масел и жиров имеют характерные общие признаки. Парофазный анализ и пиролитическая хроматография полезны при проверке аутентичности не только жировой фазы, но и других ингредиентов жировой продукции. Методом КГХ можно контролировать также состав моно- и дисахаридов. Для этого их модифицируют, переводя в летучие кремнийорганические производные.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с рефрактометрическим и ультрафиолетовым детектором обеспечивает контроль состава триглицеридов, нестабильных пероксидосодержащих жирных кислот, углеводов, антиоксидантов, жирорастворимых витаминов; эксклюзивная ВЭЖХ позволяет контролировать фракционный состав белков и пептидов.

Современные хроматографические методы определения качества жиров приведены в табл. 3.2.

Таблица. 3.2