5.7. Основы капиллярного электрофореза

Метод капиллярного электрофореза (КЭФ) появился сравни-тельно недавно. Он основан на разделении компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного элект-рического поля. Микрообъем анализируемого раствора (около 2 нл) вводят в капилляр, предварительно заполненный подходящим буфе-ром – электролитом. При подаче к концам капилляра высокого напря-жения (до 30 кВ) компоненты смеси начинают двигаться по капил-ляру с разной скоростью, зависящей в первую очередь от заряда и массы (точнее – от значения ионного радиуса), в разное время до-стигают зоны детектирования. На полученной электрофорезграмме последовательность пиков фиксирует качественную характеристику вещества (время миграции) и количественную (как в хроматограмме, высота или площадь пика, пропорциональная концентрации ве-щества).

Для более подробного представления о сущности метода рас-смотрим процессы, происходящие в капилляре, заполненном электро-литом и помещенном в продольное электрическое поле.

Плавленый кварц несет на своей поверхности почти исклю-чительно силоксановые группы > Si = O. При контакте с водой они подвергаются гидролизу и образуют силанольные группы > Si, кото-рые затем гидратируются. Скорость и степень гидролиза зависят от температуры и состава водного раствора, в частности от значения рН. Кислотные свойства поверхностных силанольных групп характе-ризуются константой диссоциации: К₁ = 4 ·10^–3, поэтому при рН > 2,5 на поверхности находятся в большем или меньшем количестве диссоциированные силанольные группы, которые придают ей отри-цательный заряд. При рН < 2 диссоциация силанольных групп прак-тически полностью подавлена и поверхность становится нейтральной.

На границе раздела кварц–водный раствор электролита воз-никает так называемый «двойной электрический слой» (ДЭС). Его обкладку составляют отрицательно заряженные гидратированные силанольные группы. В приповерхностном слое электролита к отри-цательно заряженной поверхности кварца примыкают гидратирован-ные катионы, которые образуют вторую обкладку двойного слоя. Из-за мощного электростатического взаимодействия с поверхностью часть катионов, так же как и силанольные группы, частично теряют гидратирующую воду, в результате чего первый слой катионов, непо-средственно контактирующий с поверхностью, становится весьма малоподвижным. Остальная часть нейтрализующих заряд поверхнос-ти катионов распространяется в толщу раствора, образуя так назы-ваемую диффузную часть второй обкладки двойного слоя. Распре-деление катионов между неподвижным и диффузным слоями, а следовательно, и толщина двойного слоя, зависят в первую очередь от общей концентрации электролита в растворе. Чем она больше, тем большая часть положительного заряда диффузного слоя перемеща-ется в неподвижный слой и тем меньшей становится толщина диф-фузного слоя. При концентрации бинарного однозарядного элект-ролита 10^–4–10^–3 М толщина двойного электрического слоя состав-ляет в среднем 30–50 мкм. Таким образом, при диаметре внутрен-него канала 50–100 мкм практически вся жидкость, заполняющая капилляр, представляет собой диффузную часть двойного электри-ческого слоя.

При наложении электрического поля, направленного вдоль канала капилляра, в нем возникает встречное движение носителей электрических зарядов, в том числе ионов. Так как в диффузной части двойного электрического слоя присутствует некоторая избы-точная концентрация катионов, их движение увлекает за собой (вследствие молекулярного сцепления и трения) всю массу жидкости в капилляре. Возникает так называемый электроосмотический поток (ЭОП), направленный к катоду, который осуществляет пас-сивный перенос раствора внутри капилляра. Скорость ЭОП в сильной степени зависит от рН раствора: в слабокислых растворах она отсут-ствует или незначительна, а в нейтральных и щелочных она воз-растает до максимально возможной. С другой стороны, скорость электроосмотического потока зависит от концентрации электролитов в ведущем буфере: чем больше концентрация электролитов, тем меньшая часть катионов ДЭС остается в диффузионном слое и, соот-ветственно, уменьшается максимально возможная скорость электро-осмотического потока. Наряду с этим под действием электрического поля в капилляре имеют место так называемая «электрическая подвижность ионов» и электрофоретическая подвижность других заряженных частиц. Эта сложная комбинация различных по природе и свойствам процессов, происходящих в капилляре при наложении электрического поля, используемая для аналитических целей; она получила название метода капиллярного электрофореза.

Минимально система, реализующая принципы электрофоре-тического разделения, должна иметь следующие узлы: кварцевый капилляр, источник высокого напряжения, устройство ввода пробы, детектор и систему вывода информации (рис. 5.4).

Системы капиллярного электрофореза:

– как правило, используют кварцевые капилляры с внешним полиамидным защитным покрытием: внутренний диаметр 50–75 мкм, внешний – 365 мкм, общая длина 30–100 см;

– для разделения используют положительные и отрицательные напряжения до 30 кВ;

– для ввода пробы применяют избыточное давление (гидроди-намический способ) или высокое напряжение (электрокинетический способ). Объем вводимой в капилляр пробы составляет несколько нанолитров;

– для регистрации электрофореграмм чаще всего используют УФ-детектирование непосредственно в капилляре, в прямом и кос-венном вариантах.

В приборе, реализующем метод капиллярного электрофореза, капилляр, заполненный раствором электролита, своими концами опущен в два содержащих тот же электролит сосуда, в которые вве-дены электроды. Электролит обязательно должен обладать буфер-ными свойствами, чтобы, с одной стороны, воспрепятствовать изме-нению состава раствора в приэлектродных пространствах, а с дру-гой – стабилизировать состояние компонентов пробы в процессе анализа.

Для регистрации сигналов в системе капиллярного электро-фореза используют фотометрическое детектирование с фиксирован-ной или переменной длиной волны.

Дополнительные устройства позволяют автоматизировать по-дачу образцов (автосамплер), осуществлять отвод тепла от капилляра (системы охлаждения капилляра) и управлять прибором, а также собирать и обрабатывать полученные данные с помощью програм-мных продуктов.

При подаче на электроды высокого напряжения в капилляре быстро устанавливается стационарное состояние; при данном состоя-нии через капилляр протекает постоянный электроосмотический по-ток, на который накладывается взаимно противоположная электро-миграция катионов и анионов. Если в капилляр со стороны анода (положительного электрода) ввести небольшой объем раствора пробы, то ЭОП будет переносить эту зону к катоду и зона некоторое время будет находиться в капилляре под воздействием электриче-ского поля высокого напряжения. В течение этого времени компо-ненты пробы, имеющие заряды и отличающиеся от компонентов ведущего электролита, будут перемещаться в соответствии с их электрической подвижностью, специфичной для каждого компонента. Катионные компоненты пробы, двигаясь к катоду, будут обгонять электроосмотический поток. Скорость их движения будет склады-ваться из скорости ЭОП и скорости электромиграции, поэтому на вы-ходе капилляра катионные компоненты будут появляться первыми, и тем раньше, чем больше электрическая подвижность данного иона. Нейтральные компоненты пробы будут перемещаться только под действием ЭОП и появятся на выходе, когда его достигнет зона пробы. Анионные компоненты, перемещаясь к аноду, будут двигаться с меньшими скоростями, чем скорость ЭОП. Некоторые из них, медленно мигрирующие, будут появляться на выходе после выхода ЭОП, а те, чья скорость электромиграции по абсолютной величине превышает скорость ЭОП, вообще будут выходить из капилляра в прианодное пространство.

Если время нахождения пробы в капилляре, которое можно регулировать скоростью ЭОП, напряжением или геометрическими характеристиками капилляра, достаточно, то на выходе капилляра вблизи катода можно фиксировать зоны раствора, в которых нахо-дятся индивидуальные компоненты пробы. Если тем или иным спосо-бом зарегистрировать изменение концентрации компонентов на вы-ходе из капилляра, то полученная запись называется электрофо-реграммой и может служить основой для качественного и количе-ственного анализа смеси.

Вариант зонного капиллярного электрофореза позволяет ана-лизировать компоненты, которые в условиях проведения анализа находятся в форме катионов или анионов. Однако техника капилляр-ного электрофореза может применяться и для анализа нейтральных молекулярных форм веществ вследствие различного распределения аналитов между водным раствором буфера и псевдостационарной мицеллярной фазой. Этот вариант носит название мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ). Данный принцип разделения роднит МЭКХ с обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ).

Традиционно КЭФ сравнивают с ВЭЖХ, поскольку в обоих методах разделение происходит в ограниченном пространстве (ко-лонке или капилляре) с участием движущейся жидкой фазы и для детектирования используются аналогичные принципы. Преимущест-вами КЭФ над ВЭЖХ являются:

– высокая эффективность разделения, недоступная ВЭЖХ и свя-занная с плоским профилем электроосмотического потока;

– малый расход реактивов, при этом практически не требуется применение дорогостоящих высокочистых растворителей: ацетонит-рила, метанола, гексана;

– отсутствие дорогостоящих хроматографических колонок и, следовательно, проблем со «старением» сорбента и заменой коло-нок при выработанном ресурсе;

– отсутствие прецизионных дорогостоящих насосов высокого давления, необходимых для ВЭЖХ;

– простота аппаратурного оформления;

– экспрессность анализа.

Из недостатков КЭФ нужно отметить ограниченное приме-нение метода для образцов, плохо растворяющихся в водных или разбавленных водно-спиртовых растворах; кроме того, невысокую чувствительность при регистрации сигнала в капилляре из-за малой длины оптического пути.

Примером применения КЭФ является анализ консервантов, неорганических катионов и анионов.

В безалкогольных и слабоалкогольных напитках в качестве консервирующих добавок используют бензоат натрия и сорбиновую кислоту. В данных продуктах также можно определять аскорбиновую кислоту (антиоксидант и витаминизирующую добавку) и кофеин. Анионы бензойной, сорбиновой и аскорбиновой кислот определя-ются практически в тех же условиях, что и в методике поверки, т. е. на приборе положительной полярности в виде анионов, выходящих после системного пика, в боратном буферном растворе при рН = 8,6.

На рис. 5.5 показан пример применения электрофореза для анализа консервантов, красителей, подсластителей и антиоксидантов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с использованием системы капиллярного электрофореза.

Кофеин также находится в форме недиссоциированного сво-бодного основания, которое может быть зарегистрировано в систем-ном пике, так как кофеин сильно поглощает излучение при длине волны 254 нм.

Для определения неорганических катионов ряда щелочных и щелочноземельных металлов в приборе используется источник высокого напряжения положительной полярности. Катионы движутся к катоду в том же направлении, что и ЭОП, но быстрее его. Чтобы зарегистрировать пики катионов, применяют косвенное детекти-рование.

При анализе природных вод на электрофореграмме могут наблюдаться дополнительные пики, принадлежащие другим катионам, в частности катионам двухвалентных марганца и железа. Пик марганца выходит вслед за пиком стронция, а пик железа – после пика кальция.

Для анализа неорганических анионов в приборе необходимо установить источник высокого напряжения отрицательной поляр-ности, тогда электрод на входном конце капилляра будет катодом, а электрод выходного конца – анодом и анионы будут мигрировать в сторону выходного конца, т. е. к детектору.

Примеры использования электрических и электрохимических методов:

– известны примеры использования электропроводности как показателя качества молока. Обосновывается это тем, что в анормаль-ном молоке увеличивается содержание хлоридов, которые на 75 % обусловливают электропроводность молока. Следовательно, повышенная электропроводность молока является показателем его анормальности;

– использование потенциометрии с ионоселективными электродами для определения Na и K в сточных водах, что позволяет упростить, ускорить и автоматизировать анализ сточных вод;

– для оценки качества овощей и фруктов предлагается измерять коэффициент индуцированной электрической проводимости – отношение проводимости после предварительно пропущенного через продукцию постоянного электрического микротока в прямом направлении к проводимости и в обратном направлении. Эта величина прямо пропорциональна сохранности, достоверно отражает физиологические и фитопатологические изменения задолго до видимых проявлений болезни. На основе эффекта индуцированной проводимости можно разработать коэффициент Лежко, создать автоматические индикаторы качества;

– применение вольтамперометрического метода, который позволяет одновременно в одной пробе анализировать микропримеси Сu²⁺, Рb²⁺, Cd²⁺ и Zn²⁺ в пищевых продуктах. В качестве рабочего электрода вместо широко используемого ртутного предлагается применять ртутно-графитовый. В качестве фонового электролита используется ацетатный буферный раствор;

– предлагается использовать метод селективной электролитической флотации для очистки сточных вод от жиров. Жировые час-тицы прикрепляются к пузырькам по электростатическому механиз-му в соответствии с силами электрического притяжения (отталкивания). Процессом селективной электролитической флотации можно управлять, добавляя в сточную воду реагенты, влияющие на формирование электрического заряда частиц и пузырьков. Показано, что лучше использовать Н₂ или О₂, поверхности пузырьков которых всегда имеют определенный электрический заряд. Решающими факторами, от которых зависит процесс селективной электролитической флотации, являются pH и напряжение на электродах. Изучены оптимальные условия, в которых проявляются силы электростатического взаимодействия пузырьков и флотируемых частиц;

– использование установки для автоматического определения влажности зерна. Конструкция датчика: верхний и нижний электроды находятся в прессе с регулируемым давлением. Путем вращения, подъема и опускания электродов испытываемое зерно вдавливается, через него пропускается ток, измеряется сопротивление. Поскольку для пробы используется небольшое количество зерна, во избежание погрешности измерения, обусловленной неравномерным содержа-нием влаги в общем объеме зерна, оценку влажности производят путем усреднения результатов измерений;

– применение метода для определения содержания соли в сыре. Сущность данного метода заключается в получении суспензии сыра и определении ее электропроводности, обусловленной концентрацией водорастворимых солей, а также химическим составом продукта; диапазон измерения массовой доли составляет 5–7 %, абсолютная погрешность – 0,2 %;

– использование возможности метода электрофореза для оцен-ки качества белково-сывороточного концентрата (контроль фракци-онного состава белков или количественного содержания и нативности в БСК);

– применение метода измерения влажности без отбора проб; он заключается в измерении диэлектрической проницаемости с по-мощью коаксиальной линии, к открытому концу которой подклю-чается датчик, выполненный в виде расширяющегося отрезка коаксиальной линии. Метод позволяет измерять влажность непосредственно в технологическом процессе.