4. Вивчення ізоелектричної точки білків

Для роботи необхідно: розчини: 0,01н. СН₃СООН; 0,1 н. СН₃СООН; 1 н. СН₃СООН; 0,1 н. СН₃СООNa; розчин казеїну в 0,1 н. CH₃COOONa; індикатор метилоранж; піпетка, градуйована на 10 мл; штатив з пробір- ками.

Білки, які складають основу протоплазми, мають ряд властивостей, що витікають з їх специфічної хімічної природи.

Молекули білків являють собою довгі ланцюги типу полімерів, що складаються з багатьох амінокислот.

Спрощену схему структури білкової молекули можна представити таким чином:

Зі схеми видно, що молекула білка поряд з вуглеводневим радикалом містить значну кількість полярних гідрофільних груп: –СООН; –NH₂; =СО; =NH.

У зв’язку з цим білки мають високогідрофільні властивості. При- сутність основної групи –NH₂ і кислотної –СООН зумовлюють амфотерні властивості білкової молекули, яка має основні властивості, коли пере- важає вплив аміногрупи , і кислотні, коли переважає вплив

карбоксильної групи

У водних розчинах білки проявляють властивості слабих електролітів. В цьому випадку проходить дисоціація і основної, і кислотної групи.

В кислому середовищі дисоціація карбоксильних груп понижується водневими йонами, які присутні в надлишку. При цьому білкова молекула заряджається позитивно. Наприклад, в присутності соляної кислоти про- ходить реакція:

В лужному середовищі внаслідок надлишку іонів ОН^– понижується дисоціація основної групи –NH₂ і білкова молекула заряджається нега- тивно.

Отже, при певній концентрації водневих йонів (тобто при певному значенні рН середовища) кількість йонізованих основних груп і сумарний заряд частинки буде рівним нулю, тобто система буде знаходитись в ізоелектричному стані. Концентрація водневих йонів, виражена величиною водневого показника рН, при якій молекула білка знаходиться в ізоелек- тричному стані, називається ізоелектричною точкою.

Для кожного білка існує певне значення рН, при якому він знахо- диться в ізоелектричному стані. Для більшості білків їх ізоелектрична точка лежить в кислому середовищі при рН<7.

Це пояснюється тим, що на поверхні білкової молекули переважають кислотні групи, константа дисоціації яких набагато більша від константи дисоціації основних груп. Так як в ізоелектричній точці по всій довжині молекули розташовується однакова кількість протилежно заряджених ос- новних і кислотних груп, то внаслідок електростатичних сил притягування молекула білка скручується в клубочок, стає більш компактною, густина її збільшується. Властивості, зв’язані з формою і зарядом макромолекули, при цьому змінюються. Так, наприклад, в ізоелектричному стані в’язкість, набухання, розчинність білків зменшуються. На пониженні розчинності білків в ізоелектричному стані ґрунтується методика визначення ізоелек- тричної точки казеїну.

При виконанні практичної частини роботи беруть штатив на 18 про- бірок – два ряди по 9 пробірок.

Згідно нижче приведеної таблиці в усі 18 пробірок за допомогою гра- дуйованої піпетки заливають дистильовану воду, 0,01 н.; 0,1 н.; 1 н. роз- чини оцтової кислоти. До пробірок першого ряду доливають по 1 мл свіжо приготовленого казеїну в 0,1 н. розчині оцтовокислого натрію. До пробірок другого ряду доливають по 1 мл 0,1 н. розчину оцтовокислого натрію і індикатор метилоранж. При цьому одержуємо буферні суміші з різними значеннями рН, причому в обох рядах пробірок склад буферних сумішей однаковий.

Розчинність казеїну залежить від рН середовища і в ізоелектричному стані вона найменша. Це спостерігається в найбільшому помутнінні розчину. Отже, значення рН в пробірці, де помутніння розчину казеїну найбільше, відповідає ізоелектричній точці казеїну.

Очевидно, перехід забарвлення метилоранжу від оранжевого до чер- воного в пробірках другого ряду повинен співпадати з пробіркою най- більшого помутніння в першому ряді.

Другий ряд пробірок являється контрольним. Перехід забарвлення індикатора від основного до кислого середовища повинен лежати в межах ізоелектричної точки казеїну. Для метилоранжу цей перехід лежить в межах рН = 2,7 – 4,7.

Через 5 – 10 хв. в ряді пробірок, які містять казеїн, зазначають ступінь помутніння. Відсутність помутніння позначають знаком “–”, його наяв- ність – знаком “+”. Ступінь помутніння позначають різною кількістю знаків плюс або мінус (до трьох). В другому ряді пробірок відзначають забарвлення метилоранжу – “о”; перехід забарвлення – “п”; червоне –“ч”.

Результати роботи перевіряються керівником занять. Значення рН, що відповідає ізоелектричній точці казеїну записують.