3.9. Биосенсоры

Область применения биодатчиков главным образом связана с оп­ределением состояния биологических объектов, с удовлетворением запросов медицины, сельскохозяйственного производства, пищевой промышленности, сферы обитания.

В настоящее время в медицине биодатчики используются для диагностики ряда заболеваний и контроля процессов их протекания в ходе лечения. Биодатчики могут оценивать количество глюкозы в организме, и, по-видимому, результаты этих измерений могут быть применены для поддержания нормальной концентрации инсулина в крови у больных диабетом.

В сельском хозяйстве и пищевой промышленности биодатчики могут применяться для контроля качества продукции. Например, датчики на основе мембран тиллакоидов шпината используются для определения концентрации гербицидов. В Японии созданы биодат­чики для определения гипотоксина в тканях рыбы.

В экологии биодатчики используются для наблюдения за хими­ческим составом сточных вод, воздушной и водных сфер, парамет­рами окружающей среды и др.

В настоящее время отсутствует строгое определение биодатчиков как средств измерений. Под биодатчиками обычно понимают:

а) средства определения содержания в анализируемом объекте биологических молекул и частиц;

б) системы, предназначенные для съёма сигналов измерительной информации с различных биологических объектов и их элементов;

в) средства косвенного измерения концентрации различных ве­ществ путём оценки количества продуктов ферментивной реакции;

г) датчики, содержащие биологические элементы, тесно связан­ные с преобразователями его реакции на специфическое воздействие (химическое или физическое) и выдающие удобный для обработки сигнал.

Под биодатчиком, на наш взгляд, следует понимать конструктив­но обособленную совокупность чувствительных биологических элемен­тов и измерительных преобразователей, воспринимающую одну или несколько входных величин и формирующую измерительные сигналы.

Чувствительный биологический элемент — это часть первого в измерительной цепи биодатчика, воспринимающая входной измери­тельный сигнал. В качестве чувствительного элемента используют целые организмы, ткани, клетки, органеллы, биологические мембра­ны, ферменты и их компоненты, рецепторы, антитела, нуклеиновые кислоты, органические молекулы и другие вещества.

В биодатчиках широко используются электрохимические преоб­разователи с потенциометрическими, амперометрическими, кондуктометрическими и другими цепями.

Тип биодатчика определяется прежде всего биологическим мате­риалом его чувствительного элемента. Поэтому в первую очередь сле­дует различать микробные, ферментативные, клеточные и тканевые биодатчики.

На рис.3.9.1 показана конструкция микробного датчика для опре­деления суммарного содержания усваиваемых сахаров в патоке. Этот биодатчик предназначен для определения общего содержания сахаров в бродильной среде. Он содержит чувствительный элемент из иммобилизованных (закреплённых) живых клеток Brevibacterium lactofermentum и кислородного электрода. Клетки иммобилизо­вали на куске нейлоновой сетки, размером 10*10мм², которую при­крепляли к кислородному датчику. Содержание сахаров оценивается по потреблению кислорода иммобилизованными микроорганизма­ми. Повышение, например, концентрации глюкозы приводит к уве­личению поглощения кислорода в растворе.

Рис.3.9.1. Биодатчик сахаров. 1 – целлофановая мембрана, 2 – микроорганизмы, закрепленные на нейлоновой сетке, 3 – гелиевый электролит, 4 – платиновый катод, 5 – тефлоновая мембрана, 6 – резиновое кольцо, 7 – серебряный анод.

Датчики имеют линейную зависимость между уровнем выходно­го тока и концентрацией. Время отклика биодатчика соста­вило 10 мин. Общее содержание усваиваемых сахаров рассчитывали, суммируя значения откликов на глюкозу, фруктозу и сахарозу. Раз­ность истинных и расчетных концентраций не превысила 8%. Био­датчик работал в бродильной среде для получения глутаминовой кислоты в течение 10 дней и выдержал 960 измерений. Микробные биодатчики применяются для определения концент­рации муравьиной, никотиновой, глутаминовой кислот, спиртов, аммиака и других веществ.

В ферментных биодатчиках в качестве чувствительных элемен­тов используют специальные биологические катализаторы-фермен­ты, обеспечивающие специфичность и высокую скорость биохими­ческих реакций с субстратом (веществом, химическая модификация которого катализируется ферментом). В состав такого датчика вхо­дят мембрана с иммобилизованным ферментом и вторичный измери­тельный преобразователь (амперометрический, потенциометрический и т. п.). Одна из сторон мембраны контактирует с исследуемой сре­дой, а другая с рабочей камерой вторичного измерительного преоб­разователя. Например, для измерения содержания глюкозы на мемб­рану нанесён фермент — глюкозоксидаза, в присутствии которой происходит окисление исследуемой глюкозы:

(3.9.1)

Выделяющаяся перекись водорода окисляется на разделе анод — мембрана в соответствии с реакцией: Н₂0₂ → 0₂+2Н⁺+2е. Возникаю­щий при этом ток пропорционален окисленной перекиси водорода и несет информацию о концентрации глюкозы в исследуемой среде. В биодатчике приняты меры для улучшения восприятия глюкозы в слож­ных биологических жидкостях. Приводятся такие характеристики этого датчика: диапазон концентрации глюкозы 0,2...2,0 мл (это тре­бует разбавления крови в 10 раз); функция преобразования — линей­ная; время жизни — 1 год; длительность работы с одним фермент­ным электродом — 2 недели; срок хранения при 4°С — 6 месяцев; погрешность измерения ±5%. В качестве ферментов использу­ются и другие вещества: холинооксидаза, аминокислотная оксидаза, ксантинооксидаза и др.

В тканевых биодатчиках используются растительные и живот­ные ткани: листья, цветы, плоды растений, мышцы кролика, бычья печень. Из-за наличия в тканях нескольких ферментов приходится принимать меры для разделения сигналов, например, подбором рН или температурного режима. В некоторых случаях это позволит ис­пользовать один датчик для восприятия нескольких величин. Созда­ны биодатчики из листьев кальраби (для определения концентрации перекиси водорода), тканей баклажана, картофеля, тыквы, банана, кабачка, сахарной свеклы.

На рис.3.9.2 показана конструкция биодатчика для определения глутамина с животной тканью. Концентрация глутамина служит диагностическим критерием в медицине (критерий Рея). В таком датчике тонкий слой кортекса почки свиньи закрепляется на поверх­ности рабочей части датчика, чувствительного к газообразному ам­миаку.

Клетки почки имеют высокую концентрацию фермента глутаминазы, катализирующего реакцию:

Глутаминаза

Глутамин + Н₂0 → глутаминат +NH₃ (3.9.2)

Ткань почки 2 удерживается тканевой нейлоновой сеткой 1 с раз­мером отверстий порядка 150мкм. Для зашиты газопроницаемой мембраны 5 от клеточных компонентов ткани 2 между ней и мембра­ной помещают тонкую деацетилцеллюлезную пленку 3. При взаимо­действии глутамина, поступающего из анализируемого раствора, с закреплённым катализатором (ткань почки), содержащим глутаминазу, образуется аммиак.

Измеряя концентрацию аммиака, получают информацию о содер­жании субстрата — глутамина в растворе. Тканевые глутаминовые биодатчики по своим характеристикам превосходят ферментные и микробные биодатчики.

Рис.3.9.2. Биодатчик с живой тканью. 1 – нейлоновая поддерживающая мембрана, 2 – ткань почки свиньи, 3 – внутренняя диализная мембрана, 4 – внутренний электролит, 5 – газопроницаемая тефлоновая мембрана, 6 – корпус, 7 – рН-электрод.

Таблица 3.9.1.

Основные характеристики глутаминовых биодатчиков.

В названии биодатчиков иногда отражается тип формирователей выходных сигналов (потенциометрические, амперометрические, кондуктометрические, калориметрические и др.).

По количеству воспринимаемых и преобразуемых величин мож­но выделить одномерные и многомерные биодатчики, воспринимаю­щие несколько входных величин.

Использование плодов растений (без разрушения их структуры) в качестве многомерных биодатчиков — новое перспективное направ­ление в измерительной технике. Необычайная чувствительность растений к различным факторам окружающей среды замечена ещё ботаниками и физиологами прошлого века.

Растения реагируют на ничтожные изменения интенсивности све­тового потока, обладают высокой химической чувствительностью. Реагируют на радиоактивное излучение и на малейшие изменения влажности воздуха. Высокой чувствительностью к внешним факто­ром обладают и семена растений.

Основные преимущества датчиков с плодами растений объясня­ются следующим:

• плоды обладают высокой устойчивостью к воздействию раз­личных экстремальных факторов (они сохраняют жизнеспособность при воздействии отрицательных температур в течение длительного времени);

• при использовании плодов в качестве биодатчиков существует реальная возможность создания миниатюрных датчиков, способных конкурировать с микроэлектронными датчиками;

• при проведении процедуры измерений потребуются менее слож­ные технические средства, чем при решении подобных задач с приме­нением ферментов и других биологических веществ;

• проще осуществить взаимозаменяемость чувствительных элемен­тов, так как имеется возможность отбора и сортировки по равным массе, форме, размерам и другим свойствам.

Нужно отметить, что семена арктического люпина через 5... 19 ты­сяч лет пребывания в арктической мерзлоте в норах леммингов дали всходы; через тысячу лет возвращаются к жизни семена растений Nelumbo nucifera, 110... 130 лет сохраняют жизнеспособность семена обыкновенных ячменя и овса. Этот факт показывает, что срок службы биодатчиков может быть большим. Семена плодов имеют не­большую массу и размеры. Масса плода конопли составляет 22*10^-3г, проса -4*10^-3–10*10^-3г, тмина - 2,3*10^-3 – 2,5*10^-3г.

Приведём пример использования плода гороха в датчике влаж­ности и температуры. Плод растения (рис.3.9.3) помещался в полый цилиндрический пьезоэлемент. Влажность среды изменяла объём семени. Это приводило к изменению заряда пьезоэлемента - выход­ного сигнала датчика. Кроме того, как оказалось, плоды растений реагировали на изменение температуры своей биоэлектрической ак­тивностью. Эксперимент подтвердил принципиальную возможность создания таких биодатчиков. Диапазон измерения влажности соста­вил 0...100%, а основная погрешность- не более 4%. Временная неста­бильность выходного сигнала в течение 48 ч не превысила 1,5%. Нели­нейность градуировочной характеристики была более 15% в диапазоне влажности от 14 до 97%. При измерении же температуры от 20 до 60°С датчик позволял выполнять измерение с погрешностью ± 5%.

Большой чувствительностью к влажности обладают и плоды аист­ника. В сухую погоду они закручиваются в «штопор», а во влажную — распрямляются. Корпус биодатчика на рис.3.9.4 имеет форму цилинд­рической резьбовой втулки. В верхнюю часть трубки вкручива­лась прозрачная пробка с закреплённым на ней плодом растения. Сердечник якоря индуктивного преобразователя имеет углубление для механического крепления его к остям аистника. Обмотка, изго­товленная из медного провода, дополнительно выполняет функции преобразователя температуры. При совершении гигроскопических движений (под влиянием влажности) аистника с якорем изменяется индуктивность преобразователя. Индуктивность измерялась на пе­ременном токе (10 кГц). Температура же изменяет активное сопро­тивление обмотки, и процедура измерения температуры осуществля­ется на постоянном токе.

Рис.3.9.3. Конструкция биодатчика температуры и влажности воздуха. 1,3,9 – серебряные токопроводящие электроды, 2 – плод гороха, 4 – корпус, 5 – усилитель пьезоЭДС, 6 – усилитель биопотенциалов, 7 – микроэлектрод для снятие биопотенциалов, 8 – цилиндрический полый пьезоэлемент.

Нелинейность влагочувствительной характеристики такого дат­чика составила не более 5%. При измерении же температуры датчик не уступал по точности измерения обыкновенным медным термомет­рам сопротивления порядка 2%. Быстродействие биодатчика при измерении влажности не превыси­ло 1мин.

Семена могут найти примене­ние в специальных высокочувстви­тельных средствах сигнализации и контроля: биологически активных веществ, вызывающих нежелатель­ные реакции у растений и живот­ных; наличия основных форм бак­терий; опасных соединений неко­торых химических веществ и др. В последнее время для изготов­ления биодатчиков применяется интегральная технология.

Напри­мер, в биодатчиках используются плоские узлы с вакуумным напылением электродов из платины, пал­ладия или серебра на керамическую подложку. Фермент с пастой ук­репляется с помощью ультразвука на поверхности пластины. По такой технологии изготовлен биодатчик глюкозы и лактата. Биодат­чик лактата использовался для определения его содержания в яйцах курицы с различным временем инкубации. Погрешность измерения лактата составила ±5 %. На рис.3.9.5 показана конструкция интеграль­ного биодатчика для определения концентрации глутамата.

Рис.3.9.4. Конструкция датчика температуры и влажности воздуха. 1 – пробка, 2 – корпус, 3 – плод аистника, 4 – обмотка индуктивного преобразователя, 5 – электрические выводы датчика, 6 – основание, 7 – якорь индуктивного преобразователя.

Оп­ределение концентрации L—глутаминовой кислоты — важная опе­рация в пищевой промышленности, так как эту кислоту применяют в качестве вкусовой добавки к пищевым продуктам. Чувствительным элементом служит глутаматоксидаза, которая катализирует окисле­ние глутамата, причём в ходе окисления расходуется кислород. Кис­лородный датчик состоит из газопроницаемой тефлоновой мембра­ны 7, двух золотых микроэлектродов 4 и раствора электролита 6 (0,1М КОН). К золотым микроэлектродам прикладывается напря­жение порядка 1В, так как при этом напряжении наблюдается пик тока, обусловленный восстановлением кислорода в процессе работы датчика (определено экспериментальным путем). Между этим разме­ром тока и концентрацией существует линейная зависимость.

Глутаматоксидазу закрепляли на триацетилцеллюлёзной мембра­не 8 и помещали на тефлоновую мембрану 7 кислородного микро­датчика и защищали нейлоновой сеткой 9. Испытания биодатчика приводились при определении концентрации глутамата в диапазоне от 5 до 50мМ. Нелинейность градуировочной характеристики не превысила 1%.

По виду выходного сигнала биодатчики можно условно разде­лить на активные и пассивные. В активных биодатчиках выходные ве­личины имеют энергетическую природу, в пассивных — неэнергети­ческий параметр.

Созданы активные биодатчики, входящие в тестовую систему «Эколюм» с морскими люминесцентными бактериями, уровень оп­тического свечения которых зависит от степени токсичности среды. Экспресс-анализ здесь занимает 5мин. Реагенты производятся в консервированной форме сроком хранения не менее 6 месяцев. В системе с высокой чувствительностью определяется наличие тяже­лых металлов, фенолов, пестицидов. Отмечено, что реакция системы на основные токсические вещества коррелируется с реакцией высших организмов.

Рис.3.9.5. Конструкция интегрального биодатчика для определения глутамата. 1 – кремниевая подложка, 2 – диоксид кремния, 3 – нитрид кремния, 4 – золотые электроды, 5 – корпус, 6 – электролит, 7 – тефлоновая мембрана, 8 – триацетилцеллюлезная мембрана, 9 – нейлоновая сетка.

Не только высокая чувствительность биодатчиков, но и, главное, — возможность определить концентрацию какого-либо вещества, т. е. выполнить биохимический анализ за одну операцию, определяют повышенный интерес к биодатчикам. Перспективы развития био­датчиков в будущем авторы связывают с применением генной и био­логической инженерии при создании биологических «искусственных» чувствительных элементов. Дальнейшее использование микроэлект­ронной технологии при производстве биодатчиков, развитие работ по применению микропроцессоров при обработке измерительных сигналов позволят существенно улучшить их метрологические харак­теристики и расширить область их применения.